Imágenes celulares y moleculares de la inmunoterapia basada
en células CAR-T
La terapia con células T con receptor de antígeno quimérico (CAR-T) ha surgido como
una estrategia terapéutica transformadora para las neoplasias malignas hematológicas.
Sin embargo, su eficacia en el tratamiento de tumores sólidos sigue siendo limitada. Una
comprensión profunda y completa de las vías de señalización de las células CAR-T y la
capacidad de rastrear la biodistribución y activación de las células CAR-T en tiempo real
dentro del microambiente tumoral serán fundamentales para diseñar la próxima
generación de células CAR-T para Terapia de tumores sólidos. Esta revisión resume la
red de señalización y las herramientas y plataformas de imágenes celulares y
moleculares que se utilizan en las terapias inmunes basadas en células CAR-T, abarcando
estudios tanto in vitro como in vivo. En primer lugar, proporcionamos una descripción
general de la comprensión existente sobre los mecanismos de activación y citotóxicos
de las células CAR-T, en comparación con el mecanismo de las vías de señalización del
receptor de células T (TCR). Describimos además las herramientas comúnmente
empleadas para la obtención de imágenes de células vivas, junto con el progreso de la
investigación reciente, con un enfoque en proteínas fluorescentes (FP) y biosensores
codificados genéticamente. Luego discutimos la utilidad de diversas modalidades de
imágenes in vivo, incluidas las imágenes de fluorescencia y bioluminiscencia, las
imágenes por resonancia magnética (MRI), la tomografía por emisión de positrones
(PET) y las imágenes fotoacústicas (PA), para el monitoreo no invasivo de la dinámica de
las células CAR-T. dentro de los tejidos tumorales, proporcionando así información
crítica sobre las fortalezas y debilidades de la terapia. Por último, discutimos los desafíos
actuales y las direcciones futuras de la terapia con células CAR-T.
- Introducción
La terapia con células CAR-T se está convirtiendo en un enfoque terapéutico que está
cambiando el paradigma para el tratamiento del cáncer, particularmente con el
beneficio de generar células T de memoria que pueden durar años y suprimir la recaída
del cáncer 1,2. Este enfoque terapéutico se basa en la reprogramación genética de las
células T con un CAR sintético que dirige a las células T para que identifiquen y eliminen
las células malignas que expresan los antígenos correspondientes. Se ha demostrado en
ensayos clínicos que las células CAR-T curan la leucemia y otros cánceres de la sangre1-
3
. Actualmente, existen seis productos CAR-T aprobados por la Administración de
Alimentos y Medicamentos de EE. UU. (FDA) para el cáncer de sangre. Sin embargo,
persisten desafíos importantes que impiden la aplicación de la inmunoterapia basada
en CAR a tumores sólidos. Estos incluyen toxicidades fuera del tumor que ponen en
peligro la vida, síndrome de liberación de citoquinas y eficacia insuficiente [4,5].
Nosotros y otros hemos resumido recientemente los desafíos actuales en la terapia
basada en células CAR-T y los enfoques de ingeniería para abordarlos 6,7. Aprovechar las
herramientas de imágenes avanzadas puede mejorar significativamente nuestra
comprensión de la vía de señalización de las células CAR-T, tanto in vitro como in vivo.
Cuando se combinan con enfoques de ingeniería innovadores, estas herramientas
prometen cerrar las brechas de conocimiento existentes, mitigar la toxicidad asociada a
las células CAR-T y reforzar la eficacia contra los tumores sólidos.
Las imágenes de células vivas, en particular de las moléculas de señalización dentro de
las células, revelan conocimientos críticos sobre la dinámica funcional de las células CART para atacar y eliminar las células cancerosas. Estos conocimientos son fundamentales
para establecer principios de diseño para circuitos celulares novedosos, lo que permite
que la ingeniería de células logre resultados específicos y deseados. Esta integración de
imágenes de células vivas e ingeniería de precisión está llamada a ser una piedra angular
en el desarrollo de terapias con células CAR-T de próxima generación (Fig. 1). En la
siguiente sección, presentaremos CAR y discutiremos las vías de señalización
involucradas en la activación de las células CAR-T. También discutiremos la vía de
señalización de activación de TCR. Luego, presentaremos herramientas de imágenes
celulares y moleculares codificadas genéticamente utilizadas en imágenes de células
CAR-T y resumiremos las imágenes in vivo actuales con enfoque de la terapia con células
CAR-T.
Por último, exploraremos los desafíos de la inmunoterapia basada en células CAR-T,
como los métodos inadecuados de seguimiento celular y la complejidad de los tipos de
tumores, y enfatizaremos el potencial de herramientas de imágenes novedosas y
multiplexadas para mejorar nuestra comprensión de las interacciones entre el sistema
inmune y el tumor. - Moléculas implicadas en la activación y destrucción por células CAR-T
2.1. La evolución de la molécula CAR.
Las células CAR-T son células T genéticamente modificadas para expresar CAR, donde el
CAR es un receptor sintético que combina funciones de unión a antígeno y de activación
de células T, lo que permite a las células T reconocer y erradicar células específicas
basándose en la expresión de un antígeno objetivo. 8-12. El CAR está compuesto por un
dominio de reconocimiento de antígeno tumoral extracelular, una región bisagra, un
dominio transmembrana (TM) y el dominio de señalización intracelular [13,14].
Normalmente, el dominio extracelular (ECD) es un fragmento variable monocatenario
(scFv) derivado de los dominios variables de anticuerpos unidos al dominio
transmembrana mediante una región de bisagra. El dominio de bisagra genera la
flexibilidad necesaria para la unión extracelular del scFv, mientras que el dominio TM
ancla el CAR-T a la membrana de las células T, ambos a menudo derivados de CD28 o
CD8α. El diseño del dominio de señalización intracelular ha evolucionado a lo largo de
los años de desarrollo del CAR [15] (Fig. 2A). En el CAR de primera generación, el dominio
de señalización intracelular se deriva de la molécula CD3ζ del TCR endógeno, que
contiene tres motivos de activación basados en inmunorreceptorestirosina (ITAM). Este
diseño, sin embargo, mostró una eficacia clínica limitada debido al fracaso de la
persistencia y expansión de las células CAR-T [16,17]. Para los CAR de segunda y tercera
generación, el dominio de señalización contiene uno o dos dominios coestimuladores
adicionales derivados de receptores como CD28 y/o 4-1BB (CD137), que se presentan
entre los dominios de activación TM y CD3ζ. Con funciones efectoras antitumorales
duraderas, estos diseños lograron éxito clínico en cánceres hematológicos [18-22].
Ingeniería celular guiada por imágenes
Fig. 1. Ingeniería celular y molecular guiada por imágenes de células vivas para la terapia
con células CAR-T. Las imágenes de células vivas que utilizan herramientas codificadas
genéticamente se pueden utilizar para comprender mejor y mejorar los procesos de
ingeniería de células T para terapias CAR-T, lo que implica comprender cómo las células
T diseñadas interactúan con las células cancerosas, cómo funcionan dentro de los
tumores y qué cambios se pueden hacer para mejorar su efectividad. La combinación
exitosa de estos dos aspectos allanaría el camino para el diseño de la próxima
generación de terapia CAR-T.
En la cuarta generación, el diseño de CAR incluye además dominios de señalización
intracelular que generan citocinas o utilizan la señal de citocinas para lograr la activación
completa de las células T y el control sinérgico del tumor mediante el reclutamiento de
células inmunes innatas, respectivamente [13,14]. Esta lista se está ampliando a medida
que se desarrollan nuevos diseños de CAR con diferentes dominios coestimuladores
para aumentar los beneficios clínicos en diversos tipos de cáncer [23].
2.2. Señalización implicada en la activación de las células CAR-T.
Las células CAR-T se activan para realizar sus funciones efectoras tras la interacción de
CAR con antígenos tumorales específicos [24-27]. La unión de la molécula CAR a un
antígeno tumoral objetivo desencadena la fosforilación de los ITAM CD3ζ del dominio
intracelular a través de la conexión de bisagra y el dominio TM. Esto, a su vez, permite
el acoplamiento de la proteína quinasa 70 asociada al receptor de células T de la cadena
Zeta (ZAP70) a través de sus dominios duales de homología Src 2 (SH2) con los ITAM
fosforilados, lo que induce aún más la fosforilación de las moléculas de señalización
posteriores, incluido el enlazador para la activación de células T (LAT) con dominio SH2-
que contiene proteína leucocitaria (SLP-76) y fosfolipasa C-γ1 (PLC-γ1). Estas cascadas
de señalización conectan la señal de activación del CAR a las vías de señalización de
activación de las células T endógenas, que incluyen: 1) la vía de señalización del calcio
(Ca2+)-calcineurina que da como resultado la translocación nuclear del factor nuclear
de las células T activadas (NFAT). , lo que resulta en la expresión de citoquinas; 2) la vía
de la quinasa regulada por señales extracelulares (ERK)-proteína quinasa activada por
mitógenos (MAPK) que da como resultado la activación de los factores de transcripción
corriente abajo, incluida la proteína activadora 1 (AP-1), promoviendo la diferenciación,
sobrevida y proliferación de las células T. 3) las vías del factor nuclear κB (NF-κB) que
conducen a la translocación nuclear de NF-κB, lo que resulta en la supervivencia,
proliferación y producción de citoquinas de las células T [28]. En la segunda y tercera
generación de CAR, la señal de activación de CD3ζ se combina con la señal
coestimuladora para lograr una sólida expansión y respuesta de las células CAR-T [29].
La participación de CAR conduce a la formación de una sinapsis inmunológica (IS) no
clásica entre las células CAR-T y las células tumorales. Con el proceso cíclico de contacto
transitorio entre células mediado por IS, las células CAR-T logran la destrucción selectiva
del tumor mediante la administración de moléculas efectoras citotóxicas como la
perforina y la granzima, lo que activa la vía del ligando Fas-Fas (Fas-FasL), promovido por
Fig. 2. Molécula CAR, señalización de células CAR y TCR-T. (A) Estructura de diferentes generaciones de moléculas CAR. El dominio
extracelular CAR (ECD) consta del scFv que reconoce el antígeno tumoral, que se conecta a una región bisagra, un dominio
transmembrana (TM) y un dominio de señalización intracelular. El dominio intracelular del CAR de primera generación se deriva del
ITAM que contiene CD3ζ; también contiene uno o dos dominios coestimuladores adicionales derivados de moléculas
coestimuladoras como CD28 y/o 4-1BB en los CAR de segunda/tercera generación; además incluye el dominio de señalización de
producción de citocinas en los CAR de cuarta generación. (B) Señalización de células CAR-T y muerte dirigida. Cuando CAR interactúa
con el antígeno tumoral, desencadena la activación de las células CAR-T iniciada por la fosforilación de las moléculas de señalización
proximales, incluidos los CD3ζ ITAM del dominio intracelular CAR, Lck y ZAP70. Junto con la señal coestimuladora, las células CAR-T
logran la destrucción selectiva del tumor activando la vía Fas-FasL, la entrega de moléculas efectoras citotóxicas perforina y
granzima, promovidas por citocinas secretadas. (C) Estructura y señalización del TCR. El complejo TCR comprende el heterodímero
de unión al antígeno TCRαβ y tres subunidades de señalización CD3δε, CD3γε y CD3ζζ. Cada una de las cadenas TCRα o TCRβ contiene
una ECD variable y constante, un péptido conector (CP), un dominio TM y una cola citoplasmática. Las cadenas CD3δ, CD3ε o CD3γ
comprenden cada una un ECD, un CP, un dominio TM y una cola citoplasmática que contiene un ITAM. CD3ζ tiene un ECD corto y
una cola citoplasmática con tres ITAM. Las células T también expresan el correceptor CD4 o CD8. Al interactuar con el antígeno
tumoral pMHC, la señal de activación se inició a partir de la fosforilación de tirosina de los CD3 ITAM por Lck. El correceptor CD4/CD8
también se une al MHC, estabilizando la interacción TCR-pMHC y mejorando la señal del TCR mediante el reclutamiento de Lck con
sus colas citoplasmáticas. Los CD3 ITAM fosforados luego reclutan y activan ZAP70, que fosforila aún más la proteína de andamio
LAT para permitir el acoplamiento de moléculas de señalización posteriores y conducir a la activación de las células T. Esta figura se
genera a través de BioRender.com.
citoquinas secretadas en los mecanismos sinérgicos [26,27] (Fig. 2B). La perforina forma
poros en las membranas de las células tumorales y facilita la entrada de granzimas, lo
que eventualmente conduce a la apoptosis del tumor. La apoptosis tumoral también
puede ser inducida por FasL expresado en células CAR-T que se une a moléculas de Fas
expresadas en la célula diana. Además, las citoquinas producidas por las células CAR-T,
incluido el interferón-γ (IFN-γ) y el factor de necrosis tumoral (TNF), mejoran aún más la
función antitumoral de las células CAR-T al sensibilizar el estroma tumoral e impactar
positivamente la infiltración de células T. En particular, como citocina proinflamatoria,
el IFN-γ secretado por las células CAR-T desempeña un papel importante en la activación
y el reclutamiento de otras células inmunitarias, como los macrófagos. Estas células
actúan como células efectoras y células presentadoras de antígenos, que reclutan y
activan aún más las células T citotóxicas. El IFN-γ también puede regular positivamente
la expresión del complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) de clase I y el
procesamiento de antígenos en las células tumorales, lo que facilita el reconocimiento
de las células T y la citotoxicidad. El efecto combinatorio induce una potente inmunidad
endógena, lo que resulta en una respuesta antitumoral singénica junto con el control
tumoral mediado por células CAR-T [30]. Además, el control de células CAR-T y tumores
está regulado indirectamente por muchos eventos celulares y moleculares, incluidas las
interacciones de las moléculas de adhesión 11,27,31,32. Las moléculas de adhesión en las
células tumorales y las células T infiltrantes de tumores (TIL) no solo median en la
destrucción selectiva del tumor al desempeñar un papel vital en la formación de sinapsis
inmunológica (IS), sino que también regulan la migración de las células CAR-T y su
infiltración en el tumor sólido, Sin embargo, la expresión y la actividad funcional de las
moléculas de adhesión pueden regularse negativamente en el microambiente tumoral,
lo que controla negativamente la respuesta antitumoral de las células CAR-T. Se informó
que el control tumoral mediado por células CAR-T se correlaciona con una expresión
reducida en la superficie celular de las moléculas de adhesión LFA-1 y CD2 en los TIL, y
una expresión disminuida o perdida de ICAM-1 (el ligando LFA-1) y CD58 ( el ligando
CD2) por las células tumorales. Además, el bajo nivel de magnesio extracelular (Mg2+)
en el suero de los tumores sólidos reduce la activación y la citotoxicidad de las células
CAR-T al alterar el cambio conformacional de la integrina LFA-1 a un estado de alta
afinidad. Además, la expresión de ICAM-1 en tumores sólidos ayuda en el control del
tumor de células CAR-T de manera dependiente de IFN-γ. Las células CAR-T secretan
IFN-γ tras la interacción inicial con células de tumores sólidos, lo que induce la
transcripción de ICAM-1. La expresión de ICAM-1 en células tumorales fortalece la
adhesión de las células CAR-T al tumor, aumentando la infiltración de las células CAR-T,
lo que resulta en la muerte mediada por las células CAR-T [32,33].
2.3. Comparación de células CAR-T y células TCR-T
Las células CAR-T comparten muchas similitudes con las células T endógenas,
especialmente en la vía de señalización de activación, la función celular, el desarrollo y
el destino celular. Sin embargo, también existen muchas diferencias entre estos dos
tipos de células, incluida la estructura y función de las moléculas CAR y TCR, sus señales
de activación posteriores, la organización IS formada y cómo las células T interactúan
con las células tumorales. Aprovechando las características únicas de las células CAR-T,
podemos superar mejor las limitaciones que actualmente obstaculizan su eficacia contra
los tumores sólidos. Además, la disección de los eventos moleculares involucrados en la
actividad de las células T endógenas proporciona un marco valioso para comprender el
complejo proceso de destrucción tumoral dirigida de las células CAR-T. Las técnicas de
imágenes utilizadas para el análisis de células T también son aplicables para visualizar la
actividad de las células CAR-T, lo que proporciona información sobre los mecanismos de
activación de las células CAR-T, la destrucción de tumores y el desarrollo de terapias con
células CAR-T más efectivas.
Las moléculas CAR se diseñaron para imitar los TCR endógenos; sin embargo, los CAR
son menos sensibles que los TCR en la activación inducida por antígenos. El TCR
endógeno es un complejo proteico de membrana responsable del reconocimiento de
fragmentos de antígeno como péptidos unidos a la molécula MHC (pMHC) y de la
activación de células T (Fig. 2C). El complejo TCR comprende el heterodímero de unión
al antígeno TCRαβ y tres subunidades de señalización CD3δε, CD3γε y CD3ζζ [34]. Las
cadenas TCRα y TCRβ contienen cada un dominio ECD variable y constante, un péptido
conector (CP) proximal a la membrana, un dominio TM y una cola citoplasmática corta.
El dominio variable de la cola citoplasmática, TCRα o TCRβ contiene tres regiones
determinantes de la complementariedad (CDR) que gobiernan el reconocimiento de
TCR-pMHC. Las cadenas CD3δ, CD3ε y CD3γ comprenden cada una un ECD, un CP, un
dominio TM y una cola citoplasmática que contiene un ITAM. CD3ζ tiene un ECD corto
de nueve aminoácidos y una cola citoplasmática larga con tres ITAM [35-39]. Además,
las células T también expresan el correceptor CD4 o CD8 de TCR, y esta glicoproteína
transmembrana se une a la molécula MHC de clase II o clase I [40,41]. Cuando el pMHC
interactúa con el TCR y el correceptor, la señal desencadenante comienza con la
fosforilación de tirosina de los ITAM CD3 por la proteína tirosina quinasa específica de
linfocitos de la quinasa de la familia Src (Lck). El correceptor CD4/CD8 también se une al
MHC, estabilizando la interacción TCR-pMHC y mejorando en gran medida la señal de
activación al unirse y reclutar a Lck usando sus colas citoplasmáticas. Los ITAM
fosforilados reclutan ZAP70, otra tirosina quinasa. La activación de ZAP70 fosforila la
proteína de andamiaje esencial LAT. La fosforilación de LAT facilita la unión de varias
proteínas de señalización posteriores, lo que conduce a la activación de las células T; La
señalización de TCR, junto con las señales del receptor coestimulador y del receptor de
citoquinas, da como resultado la activación completa de las células T28,42–44. CAR
reconoce el antígeno expresado en la superficie de las células tumorales a través de CAR
ECD scFv, mientras que los TCR no se limitan a los antígenos de la superficie celular, sino
que requieren que los péptidos antigénicos reconocidos sean presentados por
moléculas MHC. Si bien tanto los CAR como los TCR utilizan ITAM, el complejo TCR-CD3
completo contiene 10 ITAM con 20 sitios de fosforilación de tirosina para permitir la
detección de una cantidad mínima de antígenos, mientras que el diseño del CAR limita
el número asociado de ITAM, lo que puede conducir a diferencias en la cinética de
cascadas de señalización descendentes y funciones celulares. Con menos activación de
ITAM, ausencia de correceptores y fosforilación de moléculas de señalización corriente
abajo menos eficiente, esto resultó en al menos 100 veces menos sensibilidad de los
CAR que de los TCR 10,45–49.
Reconocimiento de pMHC. Las cadenas CD3δ, CD3ε y CD3γ comprenden cada una un
ECD, un CP, un dominio TM y una cola citoplasmática que contiene un ITAM. CD3ζ tiene
un ECD corto de nueve aminoácidos y una cola citoplasmática larga con tres ITAM [35-
39]. Además, las células T también expresan el correceptor CD4 o CD8 de TCR, y esta
glicoproteína transmembrana se une a la molécula MHC de clase II o clase I 40,41. Cuando
el pMHC interactúa con el TCR y el correceptor, la señal desencadenante comienza con
la fosforilación de tirosina de los ITAM CD3 por la proteína tirosina quinasa específica de
linfocitos de la quinasa de la familia Src (Lck). El correceptor CD4/CD8 también se une al
MHC, estabilizando la interacción TCR-pMHC y mejorando en gran medida la señal de
activación al unirse y reclutar a Lck usando sus colas citoplasmáticas. Los ITAM
fosforilados reclutan ZAP70, otra tirosina quinasa. La activación de ZAP70 fosforila la
proteína de andamiaje esencial LAT. La fosforilación de LAT facilita la unión de varias
proteínas de señalización posteriores, lo que conduce a la activación de las células T; La
señalización de TCR, junto con las señales del receptor coestimulador y del receptor de
citoquinas, da como resultado la activación completa de las células T 28,42,44. CAR
reconoce el antígeno expresado en la superficie de las células tumorales a través de CAR
ECD scFv, mientras que los TCR no se limitan a los antígenos de la superficie celular, sino
que requieren que los péptidos antigénicos reconocidos sean presentados por
moléculas MHC. Si bien tanto los CAR como los TCR utilizan ITAM. El complejo TCR-CD3
completo contiene 10 ITAM con 20 sitios de fosforilación de tirosina para permitir la
detección de una cantidad mínima de antígenos, mientras que el diseño del CAR limita
el número asociado de ITAM, lo que puede conducir a diferencias en la cinética de
cascadas de señalización descendente y en las funciones celulares, con menos activación
de ITAM, ausencia de correceptores y fosforilación de moléculas de señalización
corriente abajo menos eficiente, esto resulta en una sensibilidad al menos 100 veces
menor de los CAR comparado con los TCR 10,45–49.
La activación de TCR/CAR conduce a la formación de IS, que es crucial para la
señalización y las funciones de las células T. La calidad del IS formado predice la eficacia
antitumoral de las células T y se correlaciona con los resultados funcionales [50,51]. IS
es la interface formada entre las células T y las células tumorales, con la presencia de
moléculas de superficie como agrupaciones de TCR, correceptores y proteínas de
adhesión en las células T que forman interacciones estables con sus socios de unión en
la célula tumoral de una manera organizada y estable 52. Se forma en la interface T/célula
diana a los pocos minutos de iniciada la señal por la agregación de TCR [53] , se estabiliza
a los 5 a 30 minutos [54]. Una serie de anillos de moléculas agrupadas, que se
denominan grupos activadores supramoleculares (SMAC), forman el IS maduro iniciado
por TCR y crean la conocida estructura de sinapsis en forma de ojo de buey [55]. TCR y
PKC θ están localizados en la zona central del SMAC (cSMAC). Moléculas de señalización
como Lck, ZAP70, CD28, CD2, CD4 y CTLA4 también podrían reclutarse en el cSMAC
durante la activación de las células T [56,57]. El cSMAC está rodeado por LFA1, actina F
y talina, que comprende el SMAC periférico (pSMAC), que media principalmente la
adhesión celular. Al mismo tiempo, CD43 y CD45 se excluyen del pSMAC y se acumulan
en el SMAC distal (dSMAC) [57]. Otras quinasas, como CaMKII y PKA, también están
segregadas espacialmente en el IS para regular las funciones de las células T [58,59]. Por
el contrario, CAR IS carece de anillos de adhesión de LFA-1 distintos, depende menos de
LFA para formar conjugados estables con las células diana y forma un patrón de Lck más
desorganizado. Esto induce una señalización más rápida en las células CAR-T que en las
células T endógenas, lo que da como resultado un reclutamiento más rápido de gránulos
líticos al IS, lo que se correlaciona con un desprendimiento más rápido de la célula CART de la célula objetivo 50,60,61. En comparación con el TCR, CAR media niveles más altos
de producción de citoquinas y una destrucción de tumores más eficiente y rápida; sin
embargo, se requiere un nivel más alto de antígeno tumoral para una participación
eficaz del CAR y la liberación de gránulos citolíticos de las células CAR-T. Además, la
estimulación antigénica persistente afecta de manera más significativa la expansión de
las células CAR-T y la diferenciación efectora en comparación con las células T TCR
[62,63]. - Imágenes celulares y moleculares de la señalización CAR-T in vitro
Comprender las interacciones a nivel celular y molecular entre las células CAR-T y las
células tumorales podría ser fundamental para diseñar la próxima generación de
inmunoterapias. Con el fin de que sean utilizadas ampliamente en la investigación
proteínas fluorescentes y biosensores derivados de estas proteínas fluorescentes. Estas
herramientas han proporcionado información esencial sobre los mecanismos
moleculares que subyacen a la activación de las células CAR-T al interactuar con las
células tumorales [64]. En esta sección, revisaremos las diversas metodologías para
monitorear la dinámica de las células CAR-T a nivel celular y molecular. También
incluimos en nuestra revisión el trabajo centrado en el seguimiento de señales en las
células T normales, en lo que se refiere a la señalización de las células CAR-T.
3.1. Seguimiento de células T a nivel celular
Las proteínas fluorescentes (FP) han revolucionado el campo de la obtención de
imágenes de células T, permitiendo a los investigadores comprender el comportamiento
y la dinámica de las células T en relación con las células tumorales con un detalle sin
precedentes [65]. Al marcar las células T con una proteína fluorescente específica y las
células tumorales con otra, es posible visualizar y rastrear simultáneamente sus
interacciones dentro de un organismo vivo [60]. Esta metodología ofrece información
valiosa sobre los mecanismos de las interacciones de las células CAR-T y las células
tumorales. Por ejemplo, Wang, X., et al. incorporó una proteína fluorescente roja,
mCherry, en el extremo C-terminal de la secuencia CAR, unida por un péptido T2A
autoescindible. Para diferenciar las células tumorales de las células T, diseñaron células
tumorales que expresaran la proteína verde fluorescente (GFP). Las posiciones relativas
de las células T y las células tumorales, así como la actividad antitumoral de dos
constructor de células CAR-T, podrían monitorearse y visualizarse a lo largo del tiempo
mediante microscopía de fluorescencia en un lapso de tiempo. Los investigadores
cocultivaron células tumorales positivas para un antígeno de maduración de células B
(BCMA) y células CAR-T anti-BCMA en sus microdispositivos, empleando imágenes de
lapso de tiempo e instantáneas de puntos finales para permitir la evaluación cuantitativa
de la eficacia antitumoral de las células CAR-T. Observaron que las células CAR-T
inicialmente se distribuyeron uniformemente y finalmente se concentraron en islas de
células tumorales después de 14 h. Además, se detectó una reducción significativa en
las manchas tumorales BCMA + a las 18 h en presencia de células CAR-T anti-BCMA
mediante la cuantificación de la fluorescencia verde [66]. Murty, S., et al. Emplearon un
enfoque similar, utilizando células T extraídas de ratones transgénicos con tdTomato,
una proteína roja fluorescente, localizada en la membrana celular. Se utilizaron
imágenes confocales de lapso de tiempo para observar continuamente la actividad de
las células CAR-T marcadas con proteínas fluorescentes rojas y las células tumorales
marcadas con proteínas fluorescentes verdes [67]. Específicamente, la pérdida
progresiva de la señal de GFP indicó que el contacto entre las células tumorales GD2+ y
las células CAR-T GD2 podría desencadenar la apoptosis de las células tumorales en 50
minutos. En consecuencia, los cambios en la señal de fluorescencia a lo largo del tiempo
facilitaron la visualización de la dinámica citotóxica de las células CAR-T. La fluorescencia
se puede utilizar no sólo para rastrear la localización espacial celular sino también como
base para el desarrollo de nuevas tecnologías de imágenes. Por ejemplo, Dekkers et al.
desarrolló BEHAV3D, una plataforma transcriptómica de imágenes 3D basada en
organoides, que permite el seguimiento de la interacción dinámica de las células CAR-T
con los organoides cancerosos de pacientes para descifrar y manipular la estrategia de
células inmunes diseñadas para atacar tumores sólidos. Con BEHAV3D, los autores han
demostrado diferencias en el comportamiento entre varios productos de células T
diseñados y encontraron una firma genética única descubierta asociada con la matanza
en serie de súper participantes [65].De manera similar, el colorante de tinción de células
vivas o el anticuerpo conjugado fluorescente ofrecen facilidad experimental para marcar
las células. Por ejemplo, Schnalzger, T.E., et al. utilizó anticuerpo anti-CD45 conjugado
con aloficocianina (APC) para marcar las células asesinas naturales (NK) y teñir las células
con fluorescencia del rojo lejano [69]. Luego, estos investigadores cocultivaron células
CAR-NK con organoides tumorales que expresan GFP y organoides normales que
expresan DsRED. Las imágenes de fluorescencia revelaron que la muerte mediada por
CAR eliminó selectivamente las áreas tumorales positivas para GFP sin afectar las áreas
normales positivas para DsRED, lo que sugiere que no hay toxicidad para los tejidos
normales que carecen del antígeno de superficie correspondiente. De hecho, las células
CAR-NK se reclutaron específicamente en células tumorales positivas para GFP, pero no
en células normales adyacentes positivas para DsRED [69]. En conjunto, la obtención de
imágenes de las acciones de destrucción de CAR contra los tumores ofrece nuevos
enfoques para evaluar la eficacia terapéutica en tiempo real para estudiar la
citotoxicidad y la seguridad.
3.2. Seguimiento de moléculas señal a nivel subcelular con proteínas fluorescentes
En comparación con tinciones para imágenes de células vivas, los FP codificadas
genéticamente ofrecen la capacidad superior de rastrear la expresión o localización
espacial de proteínas específicas durante la activación de las células CAR-T. Esta ventaja
se aprovecha conjugando una proteína fluorescente con la proteína de interés en células
CAR-T vivas, lo que facilita el seguimiento de las variaciones en los niveles de expresión,
el posicionamiento subcelular y las interacciones proteína-proteína en un entorno de
tiempo real, lo que conduce a la descubrimiento de nuevos conocimientos reguladores
de células CAR-T en contextos patológicos. Al descifrar los eventos moleculares que son
críticos para la activación de los linfocitos T, los investigadores pueden diseñar
estrategias para aumentar las respuestas inmunes contra patógenos o neoplasias, o
suprimirlas en casos de autoinmunidad o rechazo de trasplantes.
La proteína tirosina quinasa no receptora ZAP70 desempeña un papel crucial en la
señalización de las células T tras su activación [70]. Específicamente, tras la activación
de las células T, ZAP70 se traslada del citosol a la membrana, donde se asocia
rápidamente con la cadena CD3ζ [71,72]. ZAP70 se acopla a ITAM fosforilados que
fueron mediados por Lck y/o Fyn quinasas en la cola citoplásmica de la cadena CD3ζ
[70,73]. Posteriormente, ZAP70 sufre fosforilación por las quinasas Lck y/o Fyn, que a su
vez fosforilan sustratos adicionales. Esta cascada de eventos inicia varias vías de
señalización intracelular, vitales para la funcionalidad óptima de las células T [74].
Inicialmente, estos hallazgos se obtuvieron a través de análisis bioquímicos, que
inherentemente carecen de la capacidad de proporcionar observaciones visuales
directas de los procesos celulares. Utilizando imágenes confocales de lapso de tiempo,
Sloan-Lancaster, J., et al. desarrolló un enfoque para visualizar la ubicación y el
movimiento de ZAP70 con respecto al tiempo en una sola célula viva [74]. Los
investigadores fusionaron una GFP con ZAP70, que se transfectó en células HeLa de tipo
salvaje y células H/TTζ (HeLa expresa establemente un CD3ζ quimérico). Este enfoque
facilitó una comparación de resultados en presencia y ausencia de una cadena TCR. Se
capturaron imágenes de lapso de tiempo después de la activación de TCR, que revelaron
una rápida translocación de ZAP70 etiquetado con GFP a la membrana plasmática en
células H/TTζ, pero no en células HeLa. Se observó una redistribución mejorada cuando
ZAP70 se coexpresó con Lck, lo que confirma directamente el papel de Lck en la
activación de ZAP70. Esto es significativo dado que la señalización CAR se basa en el
reclutamiento de ZAP70 en CD3ζ. De manera similar, en células CAR-T, Gudipati, V., et
al. también fusionó proteína verde fluorescente (GFP) con ZAP70 y lo utilizó como sonda
para la señalización CAR [49].
La aparición de una señal fluorescente verde significa participación del antígeno, y el
enriquecimiento sináptico de ZAP70-GFP se usó como medida cuantitativa para la
señalización proximal de CAR y TCR. La intensidad de la fluorescencia verde que marca
a ZAP70 en imágenes en lapsos de tiempo se capturó usando Microscopía de
fluorescencia de reflexión interna total (TIRF) para investigar los efectos de la densidad
reducida del antígeno en la activación de las células T. Este enfoque permitió la
observación directa y el análisis de los cambios en la activación de ZAP70 en diferentes
condiciones de antígeno, y condujo al hallazgo de que la insuficiente fosforilación de
ITAM mediada por Lck y la activación de ZAP70 limitan la capacidad de respuesta de las
células CAR-T a niveles bajos de antígeno. Estos hallazgos sugieren que mejorar la
eficacia de la respuesta inmune puede requerir aumentar la sensibilidad al antígeno en
las células CAR-T [49].
Este enfoque también se ha aplicado en el estudio de NFAT, que sirve como regulador
fundamental en la cascada de señalización de las células T [75] y Señalización de células
CAR-T [23]. En las células T en reposo, la NFAT está altamente fosforilada y confinada al
citosol; tras la estimulación antigénica, la calcineurina, una fosfatasa dependiente de
Ca2
, defosforila NFAT y en consecuencia revela señales de localización nuclear que
conducen a la localización de NFAT en energía nuclear, donde orquesta la expresión de
varios genes de activación de células T [76]. Lodygin, D., et al. diseñó un Sensor NFATH2B para células T fusionando NFAT con fluorescencia amarilla proteína (YFP) y proteína
histona H2B con una proteína de fluorescencia roja (mCherry), que permite la
visualización simultánea de NFAT y su localización en el núcleo de la misma célula.
Utilizando microscopia de fluorescencia de lapso de tiempo, los investigadores
registraron con éxito la dinámica NFAT durante la activación de células T. En este
estudio, cocultivaron células T con células presentadoras (APC) para estimular las células
T y examinar el movimiento NFAT. Observaron que NFAT-YFP se translocaba al núcleo.
Poco después de la interacción de las células T con las APC, alcanzando su máximo en 2-
3h post cocultivo. En las siguientes 24 h, a medida que las células T recuperaron la
motilidad y separado de las APC, el sensor NFAT se relocalizó en el citoplasma.
En particular, la frecuencia de las translocaciones nucleares de NFAT dependía según la
intensidad del estímulo antigénico, calcineurina, Ca2
, y MHC clase II, y condujo a la
regulación positiva de citocinas proinflamatorias, marcadores de activación y
proliferación celular [76].
En un estudio relacionado, Pesic, M. et al. empleó la etiqueta GFP en NFAT para
investigar su translocación en la señalización de células T. Para evitar la interferencia
con la regulación de genes endógenos por parte de NFAT nativo, los investigadores
truncaron el dominio de unión al ADN de NFAT nativo (ΔNFAT-GFP). Los autores
utilizaron ionomicina, que desencadena rápidamente la señalización del calcio y
posteriormente activa la NFAT, como estimulante de la NFAT de las células T durante un
corto período de tiempo. Estos hallazgos reflejaron observaciones anteriores: ΔNFATGFP se translocó rápidamente del citoplasma al núcleo en cuestión de minutos después
de la estimulación con ionomicina. mientras que el transporte inverso, tras la
eliminación del estímulo activador, tomó un tiempo significativamente más largo [77].
En conjunto, esto ofrece información sobre la dinámica de NFAT en la activación de
células T, presentando una confirmación visual de sus funciones subcelulares, con
implicaciones directamente traducibles a las vías CAR-T NFAT. En resumen, la obtención
de imágenes dinámicas de la activación de las células T o de las células CAR-T utilizando
los conjugados FP proporciona información valiosa sobre la respuesta de las células T a
diversos antígenos o estímulos a nivel subcelular, contribuyendo así a la elucidación de
los determinantes de T/CAR. -Destino y función de las células T in vitro.
3.3. Reporteros de actividad de proteínas basados en proteínas fluorescentes
Excepto para etiquetar células directamente o vincularlas a una molécula específica para
el seguimiento de moléculas de señalización subcelular, las proteínas fluorescentes
también se pueden diseñar para que sean indicadores de actividad molecular o
biosensores, proporcionando información en tiempo real sobre procesos celulares
específicos. Estos biosensores permiten a los investigadores rastrear las actividades de
moléculas específicas dentro de las células vivas en tiempo real. Dado que estos
biosensores pueden codificarse genéticamente, pueden modificarse genéticamente en
animales y proporcionar información dinámica en tiempo real de las moléculas de
señalización in vivo (Fig. 3).
3.4. Imágenes de activación de células CAR-T utilizando biosensor de calcio
El calcio es un segundo mensajero universal en las células y desempeña un papel crucial
en diversas vías de señalización, incluida la activación de las células T [44]. Los
biosensores de calcio, como la familia GCaMP codificada genéticamente, se han
expresado en células CAR-T para monitorear los cambios en los niveles de calcio
intracelular [78]. De estos biosensores, los biosensores de calcio basados en FRET y los
basados en FP de permutación circular única fueron los más utilizados.
Fig. 3. Biosensores codificados genéticamente para imágenes de células CAR-T vivas. (A) Un esquema de biosensores basados en FRET de ZAP70
que consta de un ECFP, un dominio SH2, un conector flexible, una secuencia de sustrato que contiene un sitio de tirosina que responde
específicamente a la quinasa ZAP70 y un dominio YPet. (B) Imágenes de relación FRET de lapso de tiempo de células CAR-T que expresan el
biosensor FRET ZAP70 antes y después del compromiso con una célula de Toledo tumoral objetivo. Las figuras A y B fueron adoptadas de la
referencia [89]. (C) Un esquema de biosensores GCaMP basados en FP única para obtener imágenes de calcio que consiste en un péptido M13,
GFP permutada circularmente (cp-GFP) como unidad informadora, dos conectores flexibles justo antes y después de la unidad informadora. La figura
se realizó basándose en la estructura proteica de PDB ID 3EKJ y 3EVR. (D) Imágenes de relación FRET de lapso de tiempo de una célula CAR-T
CD19 que expresa el biosensor de calcio y el biosensor ERK después de la interacción con una célula de Toledo tumoral objetivo. La figura fue
adoptada de la referencia [91]. En B y D, la barra de color indica la relación FRET (ECFP/FRET), con colores cálidos y fríos que representan las
relaciones alta y baja, respectivamente.
Tras la activación de las células T y CAR-T, los flujos de calcio pueden detectarse
mediante el cambio conformacional de los biosensores, lo que permite a los
investigadores visualizar y cuantificar la fuerza de la respuesta de las células T en tiempo
real. Por ejemplo, se ha monitoreado la entrada transitoria de calcio utilizando GCaMP6
como marcador de la formación y recuperación de poros de perforina en linfocitos T
citotóxicos (CTL) OT1 y mostró tasas más altas de señalización de calcio cuando los CTL
interactúan con las APC [79]. Dong et al, también diseñaron Salsa6f, una fusión de
GCaMP6f y tdTomato, que se ha optimizado para monitorear el nivel de calcio citosólico
de las células y el seguimiento de las células T. También produjeron un modelo de ratón
transgénico con Salsa6f y lograron visualizar la activación de las células T in vivo
utilizando imágenes radiométricas de señales de calcio en tejidos complejos [80].
Además, para mejorar las imágenes in vivo de los linfocitos T, Thestrup et al. optimizaron
sensores de calcio basados en FRET, o sensores ‘Twitch’, mediante una pantalla
funcional a gran escala en colonias bacterianas e identificaron Twitch2B como un
indicador útil para obtener imágenes de la motilidad y activación de las células T [81].
Más recientemente, Twitch2B se ha utilizado en imágenes intravitales de células CAR-T
anti-CD19 en ratones con linfoma de células B. Curiosamente, como la destrucción de
células tumorales se ha asociado directamente con una señalización elevada de calcio
como lo indica Twitch2B, no todos los contactos de células CAR-T muestran afluencia o
muerte de calcio, lo que sugiere heterogeneidad de las funciones de las células CAR-T
[82].
3.5. Monitoreo de la actividad quinasa en tiempo real en células vivas.
Las proteínas quinasas funcionan como nodos de señalización clave que controlan casi
todas las facetas de la función celular, incluido el metabolismo, la proliferación y la
muerte, integrando diversas vías de entrada para regular procesos fisiológicos
complejos como la función neurológica, cardíaca e inmune [83,84]. De hecho, se sabe
que varias quinasas desempeñan funciones clave en la mediación de la señalización de
TCR [43,85], que ha sido un área de investigación ampliamente centrada debido a su
importancia tanto en la fisiología como en la enfermedad. En el contexto del cáncer,
comprender las interacciones cáncer-inmune es fundamental para el desarrollo de
estrategias terapéuticas mejoradas, dadas las promesas y las limitaciones de la
inmunoterapia celular actual, por ejemplo, la inmunoterapia CAR-T. Los biosensores
fluorescentes de actividades quinasas basados en proteínas han revolucionado la forma
en que estudiamos estos reguladores clave y han permitido el interrogatorio directo de
las proteínas quinasas en sus contextos biológicos nativos. La tirosina quinasa del bazo
(SYK), por ejemplo, es un factor crucial en la señalización posterior de
inmunorreceptores como los ITAM, y se ha desarrollado un biosensor basado en SYK
FRET para visualizar la activación en tiempo real de SYK en células vivas [86]. ZAP70, que
es miembro de la familia SYK y desempeña un papel esencial en la señalización de TCR,
también se ha monitorizado en células T vivas individuales utilizando un biosensor
basado en FRET [87]. Wan et al han diseñado un biosensor ZapLck FRET sensible
utilizando el sustrato ZAP70, que, tras la activación de la quinasa Lck, se une al dominio
Src SH2, provocando cambios en la relación FRET [88]. Más recientemente, Liu et al
desarrollaron un biosensor ZAP70 FRET, que se ha utilizado para dilucidar las funciones
de ITAM en la activación de ZAP70 para regular las funciones del CAR. Específicamente,
al utilizar los biosensores ZAP70 y ERK, se encontró que ZAP70 y ERK responden a la
estimulación antigénica en células CAR-T, y se observó un nivel de activación reducido
de la actividad ZAP70 en células CAR-T con solo un ITAM funcional en comparación con
el tipo salvaje. Células CAR-T con tres ITAM funcionales, en contraste con la actividad
ERK que no cambió significativamente [89]. Centrándose específicamente en el receptor
de la hormona estimulante de la tiroides (TSHR) que se dirige a las células CAR-T en el
tratamiento de los cánceres de tiroides, también se han visualizado las actividades
dinámicas de ZAP70 y ERK utilizando biosensores ZAP70 y ERK tras la estimulación con
antígenos [90]. Los biosensores ZAP70 y ERK también se utilizaron en otro estudio en el
que Duan et al generaron un único ITAM que contenía un CAR dirigido a CD19 y
observaron una activación similar de ZAP70 pero una activación de ERK más rápida en
células CAR-T con un ITAM funcional en comparación con las células CAR-T originales.
[91]. Sin embargo, si bien los biosensores codificados genéticamente proporcionan
información instrumental sobre la señalización de las células CAR-T, su aplicación más
amplia a menudo se ve limitada por su baja sensibilidad. Se estableció un método
novedoso llamado FRET-Seq para abordar este problema de bibliotecas a gran escala
directamente en células de mamíferos, utilizando el diseño de biosensores FRET
autoactivadores (saFRET). Mediante el uso de este enfoque, se han identificado
biosensores sensibles de Fyn y ZAP70, lo que permite obtener imágenes dinámicas de
células T activadas a través de señalización TCR endógena o señalización CAR [89]. - Imágenes de la terapia CAR-T in vivo
Como se mencionó anteriormente, la terapia con células CAR-T ha logrado un éxito
notable en el tratamiento de neoplasias malignas hematológicas, pero su aplicación en
tumores sólidos aún enfrenta desafíos importantes. Una limitación importante es la
incapacidad de controlar eficazmente la biodistribución y el estado de activación de las
células CAR-T dentro del tumor utilizando técnicas de imágenes clínicas convencionales.
Las imágenes in vivo de la terapia con células CAR-T tienen el potencial de mejorar
significativamente nuestra comprensión de la eficacia y las limitaciones de la terapia, lo
que conducirá al desarrollo de estrategias más efectivas para el tratamiento de tumores
sólidos. Las técnicas actuales para monitorear las células CAR-T, como el análisis de
sangre periférica y las biopsias de tumores de un solo sitio, son inadecuadas para evaluar
la respuesta al tratamiento en múltiples sitios metastásicos. Además, las imágenes
tradicionales de tumores por sí solas son insuficientes para interpretar la respuesta a la
terapia con células CAR-T. Al emplear técnicas avanzadas de imágenes moleculares, se
puede lograr un seguimiento no invasivo de la biodistribución, el estado de activación y
la cinética de las células CAR-T en los tejidos. Esta información espacial, temporal y
funcional permite una evaluación más completa de la respuesta al tratamiento y la
identificación de barreras potenciales, como el secuestro pulmonar, la acumulación
ineficiente de tumores y la heterogeneidad del antígeno diana. Al perfeccionar nuestra
comprensión de la terapia con células CAR-T a través de imágenes in vivo, podemos
abordar mejor los desafíos que enfrentan los ensayos clínicos con tumores sólidos y
trabajar para brindar opciones de tratamiento más efectivas para un mayor número de
pacientes. En esta sección, revisaremos varias modalidades de imágenes que se han
empleado en imágenes in vivo y las discutiremos en el contexto de la terapia CAR-T (Fig.
4).
4.1. Imágenes de fluorescencia
Las imágenes de fluorescencia son una herramienta poderosa para estudios celulares in
vitro debido a su alta sensibilidad, facilidad de uso y capacidad para multiplexar
múltiples señales. Sin embargo, su aplicación in vivo a menudo está limitada por factores
como la penetración tisular, la autofluorescencia y el fotoblanqueo. Los investigadores
han desarrollado diversas técnicas y estrategias para superar estas limitaciones. Las
imágenes de dos fotones son particularmente prometedoras para las imágenes in vivo
debido a su mayor penetración en el tejido, reducción de la señal de fondo y reducción
del fotoblanqueo. Este método utiliza la absorción simultánea de dos fotones para
excitar un fluoróforo. En la excitación de dos fotones (TPE), cada fotón posee la mitad
de la energía de un fotón en la excitación convencional de un fotón. Como resultado, la
longitud de onda de excitación en TPE es aproximadamente el doble que la de la
excitación unifotónica. Por ejemplo, si un fluoróforo absorbe luz a 400 nm bajo
excitación convencional, requerirá dos fotones simultáneos mediante iluminación
infrarroja a alrededor de 800 nm, lo que reduce la probabilidad de fotoblanqueo y
citotoxicidad [92].
Un artículo intrigante publicado en 2019 mostró el potencial de la microscopía de dos
fotones para investigar la actividad de las células CAR-T a nivel unicelular in vivo [82].
Los investigadores intentaron abordar varias cuestiones relativas a la actividad de las
células CAR-T y la regresión tumoral, centrándose particularmente en las interacciones
celulares y el escape del tumor en diferentes sitios anatómicos. Mediante el uso de
imágenes intravitales en un modelo de ratón de linfoma agresivo de células B,
observaron que las células CAR-T que interactuaban con objetivos circulantes quedaban
atrapadas en los pulmones como grandes agregados de células. Además, el estudio
encontró que las células CAR-T mostraban una amplia heterogeneidad funcional en el
sitio del tumor, pero eran capaces de matar rápidamente a sus objetivos, lo que
contribuía directamente a la regresión del tumor. Además, el estudio reveló diferencias
anatómicas en la inmunoedición de tumores asociadas con niveles variables de actividad
citotóxica.
En general, los investigadores concluyeron que los resultados de las interacciones de las
células CAR-T en vivo son muy diversos y están influenciados tanto por propiedades
funcionales como por especificidades anatómicas, lo que enfatiza la importancia de la
microscopía de dos fotones para descubrir estas intrincadas interacciones.
La microscopía de dos fotones tiene ciertas limitaciones, incluida una profundidad de
penetración restringida de hasta 1 mm y un campo de visión más pequeño [93]. A
menudo requiere procedimientos invasivos, como la extirpación de tejido o el uso de
una ventana craneal, y depende de la presencia de moléculas fluorescentes para la
obtención de imágenes [94]. A pesar de estos inconvenientes, su alta resolución celular
y subcelular lo convierte en una herramienta valiosa para estudiar procesos biológicos
a nivel celular y molecular in vivo.
Fig. 4. Modalidad de imágenes in vivo utilizada para imágenes de células CAR-T. En este cuadro, se resumieron los
pros y los contras de los enfoques de imágenes disponibles actualmente para el uso del seguimiento de células CART in vivo (consulte la Tabla complementaria 1). Esta figura se genera a través de BioRender.com.
4.2. Imágenes de bioluminiscencia
La obtención de imágenes por bioluminiscencia (BLI) es una técnica ampliamente
utilizada en estudios preclínicos con animales para el seguimiento in vivo de células y la
notificación de eventos biológicos. BLI aprovecha la acción catalítica de las enzimas
luciferasa en sus respectivos sustratos para producir una señal bioluminiscente,
facilitando la visualización no invasiva de las células dentro de los organismos vivos [95].
Los reporteros basados en luciferasa ofrecen relaciones señal-fondo superiores, lo que
permite la detección sensible y la obtención de imágenes de células en regiones de
tejido profundo, superando a los métodos basados en fluorescencia. El proceso
normalmente implica la interacción entre una enzima luciferasa y un sustrato emisor de
luz, llamado luciferina, en presencia de oxígeno. Esta interacción conduce a una reacción
de oxidación catalizada por enzimas, que da como resultado la conversión de energía
química en luz. En las últimas décadas, el campo de las imágenes por bioluminiscencia
ha crecido rápidamente, y los investigadores han desarrollado nuevas luciferasas,
luciferinas y equipos de imágenes. Esto ha llevado a una mayor sensibilidad, resolución
y capacidad para estudiar procesos biológicos más complejos en organismos vivos. Entre
las luciferasas comúnmente empleadas en la investigación, se encuentran la luciferasa
de luciérnaga, Renilla luciferasa y, más recientemente, luciferasa NanoLuc se destacan
como opciones populares. La luciferasa de luciérnaga, originaria de la luciérnaga común
(Photinus pyralis), es reconocida por su alta intensidad de señal y versatilidad en
diversas aplicaciones. La renilla luciferasa, procedente del pensamiento marino (Renilla
reniformis), sirve como indicador bioluminiscente alternativo y se utiliza con frecuencia
en ensayos de indicador dual junto con la luciferasa de luciérnaga [95]. La luciferasa
NanoLuc, una variante más pequeña diseñada derivada del camarón de aguas profundas
Oplophorus gracilirostris, ofrece un brillo y estabilidad excepcionales, lo que la convierte
en una opción atractiva para escenarios de imágenes desafiantes [96]. Si bien BLI ha sido
una herramienta invaluable para estudios preclínicos, su limitada penetración en los
tejidos, la falta de imágenes en tiempo real y el requisito de sustratos exógenos lo hacen
menos adecuado para aplicaciones clínicas en humanos.
En la investigación del cáncer, la aplicación predominante de BLI implica evaluar la masa
y la ubicación de células tumorales xenoinjertadas que expresan constitutivamente un
gen de luciferasa. Este enfoque ofrece un método fiable para controlar la eficacia de los
tratamientos antitumorales in vivo, incluida la inmunoterapia [97,98]. Las imágenes de
tumores basadas en BLI se pueden combinar con diferentes modalidades de imágenes,
como PET, MRI o imágenes fotoacústicas, para rastrear las células CAR-T y proporcionar
información completa sobre su distribución, función e interacciones con el
microambiente del tumor. Al integrar múltiples técnicas de imágenes, los investigadores
pueden obtener información valiosa sobre la dinámica compleja de las respuestas
inmunes mediadas por células CAR-T y optimizar las estrategias terapéuticas para
mejorar los resultados del tratamiento del cáncer.
4.3. Imagen de resonancia magnética
La resonancia magnética (MRI) es una técnica de imágenes médicas no invasiva
ampliamente utilizada para visualizar las estructuras internas y Procesos del cuerpo con
alta resolución espacial. Introducida en la década de 1970, la resonancia magnética se
ha convertido en una herramienta fundamental en el diagnóstico y la investigación
clínicos debido a su capacidad para proporcionar imágenes detalladas de diversos
tejidos, incluidos el cerebro, los músculos, los órganos y los vasos sanguíneos. El
principio subyacente de la resonancia magnética implica la interacción entre ondas de
radiofrecuencia y átomos de hidrógeno dentro del cuerpo en presencia de un fuerte
campo magnético. Cuando se colocan en un campo magnético, los núcleos de hidrógeno
(protones) se alinean con la dirección del campo. Luego, un pulso de energía de
radiofrecuencia perturba esta alineación, lo que hace que los protones resuenen. Una
vez que se apaga el pulso, los protones vuelven a su alineación original, liberando
energía en el proceso. El tiempo y la trayectoria de la energía liberada se detectan y
convierten en imágenes que revelan las estructuras internas del cuerpo.
La resonancia magnética ofrece varias ventajas sobre otras modalidades de imágenes,
incluida su capacidad para generar imágenes tridimensionales de alta resolución sin el
uso de radiación ionizante, lo que la hace más segura para los pacientes. Es muy sensible
al contraste de los tejidos blandos, lo que permite una diferenciación precisa entre
varios tipos de tejidos y la detección de cambios patológicos. Además, la resonancia
magnética puede proporcionar información funcional, como el flujo sanguíneo y el
consumo de oxígeno, lo que la convierte en una técnica de imagen versátil para una
amplia gama de aplicaciones clínicas, desde el diagnóstico de trastornos neurológicos
hasta la evaluación del progreso de los tratamientos contra el cáncer.
Varios estudios han destacado la utilidad de la resonancia magnética (MRI) en el
seguimiento de las terapias con células CAR-T. Xie et al. adoptó partículas
superparamagnéticas ultrapequeñas de óxido de hierro (USPIO), específicamente
ferucarbotrán, para marcar células CAR-T para la monitorización no invasiva de la
infiltración cinética y la persistencia en modelos de glioblastoma [99]. Los resultados
mostraron que se podían detectar señales de hipointensidad crecientes en modelos de
glioblastoma hasta 14 días después de la inyección de células CAR-T marcadas con
USPIO. Ampliando aún más la utilidad de la resonancia magnética para el seguimiento
de células CAR-T, Dubois et al. utilizaron con éxito la resonancia magnética con flúor-19
(19F) para visualizar células CAR-T en un modelo de leucemia en ratones. Al marcar las
células con perfluorocarbono (PFC), demostraron que la resonancia magnética 19F
podía detectar células CAR-T marcadas con PFC hasta 7 días después de la inyección
intratumoral sin afectar la citotoxicidad de las células [100]. En una línea de
investigación complementaria, un equipo desarrolló un enfoque clínicamente traducible
para marcar células CAR-T con nanopartículas de óxido de hierro, lo que permite la
detección no invasiva mediante resonancia magnética, imágenes fotoacústicas (PAT) e
imágenes de partículas magnéticas (MPI) [101]. Utilizaron un dispositivo de microfluidos
hecho a medida para el etiquetado de células T mediante mecanoporación, preservando
la proliferación, viabilidad y función de las células T y al mismo tiempo logrando una
absorción significativa de nanopartículas.
Este enfoque facilitó la visualización de la localización de las células T en osteosarcomas
y sitios fuera de objetivo, una hazaña inalcanzable con células no marcadas. Este estudio
marca un hito importante en la aplicación clínica de la resonancia magnética para
monitorear las terapias con células CAR-T en tumores sólidos.
En el contexto de la terapia con células CAR-T en las clínicas, la resonancia magnética
asume un papel fundamental en la evaluación de complicaciones como el síndrome de
neurotoxicidad asociado a células efectoras inmunitarias (ICANS), un efecto adverso
común [102,103]. La patogénesis de ICANS implica una respuesta inflamatoria que altera
la barrera hematoencefálica y activa las células microgliales, lo que conduce a
neurotoxicidad. Dada la capacidad de la resonancia magnética para proporcionar
imágenes tridimensionales de alta resolución sin el uso de radiación ionizante, ofrece un
método más seguro para monitorear estos cambios neurológicos. De hecho, la alta
sensibilidad de la resonancia magnética al contraste de los tejidos blandos permite la
detección de alteraciones fisiopatológicas como el edema cerebral, una característica
notable de la ICANS grave [104]. Además, la resonancia magnética puede ayudar a
excluir otras anomalías neurológicas agudas, como el accidente cerebrovascular
isquémico o hemorrágico, y facilitar la observación de hallazgos menos comunes, como
anomalías de señal hiperintensas en imágenes FLAIR y potenciadas en T2, realce
leptomeníngeo y microhemorragias multifocales asociadas con ICANS [105,106]. Por lo
tanto, la capacidad de la resonancia magnética para proporcionar información
estructural y funcional detallada es crucial en el diagnóstico, seguimiento y manejo de
ICANS durante la terapia con células CAR-T.
4.4. Tomografía de emisión de positrones
La tomografía por emisión de positrones (PET) es una técnica de imágenes médicas no
invasiva que se utiliza para visualizar la actividad metabólica y los procesos funcionales
dentro del cuerpo. Introducida en la década de 1960, la PET se ha convertido en una
herramienta esencial en el diagnóstico y la investigación clínicos, particularmente en los
campos de la oncología, la neurología y la cardiología. El principio subyacente de la PET
implica el uso de radiotrazadores, que son moléculas biológicamente activas marcadas
con un radionucleido emisor de positrones. Estos radiotrazadores se inyectan en los
pacientes y se acumulan en zonas del cuerpo con actividad metabólica específica. A
medida que el radionúclido se desintegra, emite positrones, que interactúan con los
electrones cercanos y producen pares de fotones gamma. Estos fotones son detectados
simultáneamente por detectores que rodean al paciente y los datos recopilados se
utilizan para reconstruir imágenes tridimensionales de la distribución del trazador
dentro del cuerpo.
Entre sus ventajas frente a otras modalidades de imagen, la PET proporciona
información cuantitativa sobre procesos metabólicos y funcionales, como el
metabolismo de la glucosa o el flujo sanguíneo. Esta información puede ayudar a los
médicos a identificar y caracterizar diversas enfermedades, como tumores cancerosos,
trastornos neurodegenerativos y enfermedades cardíacas. Además, la PET se puede
combinar con otras técnicas de imagen como la tomografía computarizada (TC) o la
resonancia magnética para proporcionar información tanto funcional como estructural,
mejorando así la precisión del diagnóstico y guiando las decisiones de tratamiento. Sin
embargo, una limitación de la PET es su dependencia de la radiación ionizante, que
puede representar un riesgo para los pacientes cuando se usa con frecuencia o en dosis
altas.
En el contexto de la terapia con células CAR-T, se pueden emplear tanto la PET como la
tomografía computarizada por emisión de fotón único (SPECT) para monitorear la
biodistribución, expansión y persistencia de las células infundidas. Por ejemplo, Weist
et al. demostró la eficacia del marcaje con 89Zr-oxina de células CAR-T [107]. Este
método mantuvo la viabilidad y funcionalidad celular, permitiendo el seguimiento de
células CAR-T en modelos murinos de glioblastoma y tumor de próstata mediante PET.
De manera similar, Sellmyer et al. desarrollaron sondas PET basadas en antibióticos
trimetoprima (TMP) capaces de obtener imágenes de la expresión de la enzima
dihidrofolato reductasa de Escherichia coli (eDHFR) [108]. Este enfoque facilitó la
detección temprana de células CAR-T en el bazo y su posterior redistribución a tumores.
Lee y cols. hicieron más avances mediante el uso de células CAR-T marcadas con 89ZrDFO para imágenes PET, lo que permitió el tráfico de células in vivo en tiempo real [109].
Esta técnica podría ser valiosa para investigar la cinética celular, la biodistribución inicial
in vivo y para establecer perfiles de seguridad en el futuro desarrollo de células CAR-T.
Simoneta y cols. propusieron el uso de imágenes ICOS-inmunoPET para monitorear la
terapia con células CAR-T, un enfoque que reveló intensidades de señal más altas en
sitios esqueléticos específicos que contienen médula ósea en ratones tratados con
células CAR-T en comparación con los controles [110]. Sta María et al. Emplearon
imágenes PET en serie con 89Zr-oxina para determinar la dosis óptima para células
huLym-1-A-BB3z-CAR-T dirigidas a xenoinjertos de linfoma Raji Lym-1 positivo en
ratones NSG [111]. Observaron una biodistribución dosis dependiente de las células
CAR-T en todas las regiones, incluido el tumor. Curiosamente, observaron que las células
CAR-T administradas por vía intravenosa inicialmente se alojaron en el pulmón durante
unas horas antes de migrar al hígado y al bazo en el transcurso de unos días. Estos
ejemplos ilustran el potencial de la PET y la SPECT para proporcionar información crucial
sobre el comportamiento de las células CAR-T in vivo, que podría informar el diseño de
terapias futuras.
4.5. Imágenes fotoacústicas
La imagen fotoacústica (PAI) es una modalidad de imagen biomédica híbrida, no
invasiva, que combina los puntos fuertes de las técnicas de imagen óptica y ecográfica
[112]. Se introdujo por primera vez a principios de los años 1990 y desde entonces ha
atraído una atención significativa en los campos de la biología, la medicina y el
diagnóstico. El principio detrás de PAI implica la generación de ondas acústicas en tejidos
biológicos después de la absorción de luz láser pulsada. Cuando los tejidos absorben la
luz del láser, experimentan una rápida expansión termoelástica, creando ondas
ultrasónicas que pueden detectarse y usarse para reconstruir imágenes de alta
resolución de la estructura del tejido.
A pesar de ser un campo relativamente nuevo, PAI ha tenido éxito en modelos
preclínicos, al obtener imágenes de varias células inmunes, como células dendríticas,
células asesinas naturales y células T. Si bien PAI ofrece varias ventajas sobre los
métodos de imágenes ópticas convencionales, incluida una profundidad de penetración
más profunda y una resolución espacial más alta, tiene un campo de visión restringido y
un límite de penetración de profundidad de aproximadamente 5 cm, lo que lo hace
menos adecuado para imágenes de cuerpo entero.
En el contexto de la terapia con células CAR-T, Kiru et al. demostró un enfoque
clínicamente traducible para marcar células CAR-T con nanopartículas de óxido de
hierro, lo que permite una detección no invasiva mediante resonancia magnética, PAI e
imágenes de partículas magnéticas (MPI). Confirmaron los hallazgos de la resonancia
magnética utilizando PAI, observando un aumento significativo en la señal fotoacústica
una semana después de la inyección de células CAR-T B7-H3 marcadas con ferumoxitol,
lo que indica una acumulación de células CAR-T en los tumores de osteosarcoma,
seguido de una disminución en señal en la segunda semana. Esta demostración no sólo
muestra el potencial del PAI en el seguimiento celular no invasivo, sino que también
destaca su compatibilidad con otras modalidades de imágenes. Como tal, PAI ofrece un
complemento prometedor a otras modalidades de imágenes como MRI, PET e imágenes
ópticas para el análisis y monitoreo en profundidad de las células CAR-T en modelos
preclínicos y potencialmente en entornos clínicos.
4.6. Desafíos y direcciones futuras
Las inmunoterapias basadas en células CAR-T han alterado drásticamente el panorama
del tratamiento de los cánceres de sangre; sin embargo, aún quedan muchos desafíos
por abordar para su uso clínico más amplio. Los obstáculos que obstaculizan la aplicación
universal de la terapia CAR T incluyen el seguimiento inadecuado de las células T, la
diversidad dentro de los tipos de tumores, un microambiente tumoral inhibidor (TME) y
el agotamiento de las células T (6).
Se han documentado efectos secundarios potencialmente mortales debido a la
liberación de citocinas y la citotoxicidad de las células CAR-T, como el síndrome de
liberación de citocinas (SRC), la neurotoxicidad, el síndrome de lisis tumoral y la
enfermedad de injerto contra huésped (EICH) [113]. . Especialmente, la toxicidad en el
objetivo fuera del tumor, que es inducida por el reconocimiento y la destrucción de
tejidos normales mediada por células T CAR que expresan el antígeno objetivo, se ha
convertido en una barrera importante a la hora de traducir los éxitos en el tratamiento
del cáncer hematológico en el control de tumores sólidos. [114]. Comprender el
mecanismo molecular de las actividades antitumorales de las células CAR-T bajo TME
inspiraría un nuevo enfoque de ingeniería para el desarrollo de la terapia con células
CAR-T de próxima generación que equilibre la seguridad y la eficiencia del tratamiento
mediante el uso de CAR controlado espaciotemporalmente o controlado por lógica. –
Células T (7). Además, cabe señalar que el ámbito de la terapia CAR T se extiende más
allá de la oncología. Si bien nuestro enfoque principal en esta revisión son las terapias
con CAR T dirigidas al cáncer, las innovaciones han abarcado un espectro de
enfermedades, abarcando la autoinmunidad con herramientas como los receptores de
autoanticuerpos quiméricos (CAAR) [115] y las células T reguladoras con CAR (CAR Tregs)
[ 116], así como aplicaciones en alergias, asma, enfermedades infecciosas e incluso en
el manejo del VIH, como se resume en una revisión dedicada [117]. Sin embargo, estas
aplicaciones no relacionadas con el cáncer, aunque prometedoras, se encuentran en las
primeras etapas y enfrentan desafíos como efectos fuera del objetivo. Las técnicas de
imagen avanzadas pueden ser cruciales para monitorear el comportamiento de las
células CAR-T, mejorando la seguridad y eficacia en estos contextos. Los avances
contemporáneos en las técnicas de imagen han facilitado la exploración de moléculas
de señalización dentro de las células vivas; sin embargo, estas moléculas no funcionan
de forma aislada, y la orquestación de varias moléculas de señalización en términos de
coordinación espacial y temporal para las acciones unificadas de las células T y las células
CAR-T sigue siendo un misterio complejo. Podemos prever la progresión de nuevas
herramientas de imágenes y la adopción de metodologías de imágenes multiplexadas
[118], que ofrecen una alta resolución espacial y temporal dentro de una célula CAR-T
individual y se prevé que mejoren nuestra comprensión de los mecanismos moleculares
que gobiernan el sistema inmune-tumoral. interacciones. Este avance debería acelerar
el desarrollo Se ha demostrado que las modalidades de imágenes in vivo, incluidas FLI,
BLI, MRI, PAT y PAI, son herramientas fundamentales para rastrear y comprender el
comportamiento de las células CAR-T. Cada método presenta ventajas únicas y desafíos
potenciales, lo que subraya la necesidad de un enfoque integrador para obtener una
visión integral de la dinámica de las células CAR-T in vivo. BLI y FLI ofrecen ventajas en
sensibilidad y capacidad de visualizar múltiples objetivos simultáneamente. Sin
embargo, su aplicación está limitada por su baja resolución espacial, su limitada
penetración en profundidad y, en el caso de FLI, el potencial de autofluorescencia
tisular. Por el contrario, la resonancia magnética ofrece información anatómica
detallada y la capacidad de visualizar células en lo profundo de los tejidos, pero está
limitada por su menor sensibilidad y necesidad de agentes de contraste. La modalidad
más reciente, PAI, proporciona una alta resolución espacial y una visualización del tejido
más profunda en comparación con las técnicas de imágenes ópticas, aunque su campo
de visión es limitado y tiene una penetración profunda limitada. Desarrollar una
estrategia óptima para la obtención de imágenes in vivo de células CAR-T es crucial para
mejorar nuestra comprensión de su acción terapéutica y su posible toxicidad. Sin
embargo, lograr este objetivo requiere superar las limitaciones actuales y perfeccionar
estas técnicas. Las investigaciones futuras deberían centrarse en mejorar los métodos
de etiquetado celular, desarrollar nuevos agentes de contraste altamente sensibles y
mejorar aún más la resolución y la sensibilidad de las imágenes. A pesar de los desafíos,
las imágenes in vivo de células CAR-T representan un campo vibrante y en rápida
evolución. Gracias a los continuos esfuerzos de investigación, estas técnicas de
imágenes se convertirán en herramientas cada vez más poderosas, permitiendo una
comprensión más clara de la dinámica de las células CAR-T en el cuerpo vivo y
potencialmente conduciendo a mejoras significativas en la efectividad de las terapias
con células CAR-T.
Declaración de intereses en competencia
Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia ni relaciones
personales conocidas que pudieran haber influido en el trabajo presentado en este
artículo.
Disponibilidad de datos
No se utilizaron datos para la investigación descrita en el artículo. No se utilizaron datos
para la investigación descrita en el artículo.
Expresiones de gratitud
Los autores se disculpan por no incluir trabajos publicados relevantes debido a
limitaciones de páginas. Este trabajo fue financiado en parte por subvenciones de los
Institutos Nacionales de Salud a través de los premios CA262815, GM140929, HD107206
y HL121365.
Contribuciones de autor
L.L, C.W.Y y Z. Y. contribuyeron igualmente a este trabajo. Todos los autores
enumerados han hecho una contribución directa e intelectual al trabajo y aprobaron su
publicación.